熒光光譜法

• 原理：利用熒光分光光度計測量標記前后血紅蛋白溶液的熒光強度。由于熒光素標記后會使血紅蛋白具有特定的熒光發(fā)射峰，通過比較標記前后在相應波長下的熒光強度變化，可計算出標記效率。

• 步驟：首先，用熒光分光光度計對未標記的血紅蛋白溶液進行掃描，確定其本底熒光強度。然后，對標記后的血紅蛋白溶液在熒光素的特征發(fā)射波長下進行熒光強度測量。標記效率可通過公式計算：標記效率 =（標記后熒光強度 - 未標記時本底熒光強度）/ 理論最大熒光強度 ×100%。

凝膠電泳法

• 原理：根據標記與未標記血紅蛋白在凝膠電泳中的遷移率差異來判斷標記情況。標記后的血紅蛋白由于結合了熒光素，分子量會增加，在凝膠中的遷移速度會變慢，通過比較電泳條帶的位置和亮度來確定標記效率。

• 步驟：將未標記和標記后的血紅蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，用熒光成像儀或紫外燈觀察凝膠中的條帶。如果標記效率高，標記后的血紅蛋白條帶會滯后于未標記的血紅蛋白條帶，且熒光強度較強。通過對條帶的灰度值或熒光強度進行定量分析，可計算出標記效率。

流式細胞術

• 原理：當細胞或顆粒被熒光素標記后，流式細胞儀可以檢測到其發(fā)出的熒光信號。通過分析標記后細胞或顆粒的熒光強度分布，與已知標準或未標記對照進行比較，從而確定標記效率。

• 步驟：將標記后的血紅蛋白與適當的細胞或微球混合，使血紅蛋白結合到細胞或微球表面。然后將樣品加入流式細胞儀中進行檢測，設置合適的熒光通道和閾值，收集熒光信號。根據熒光陽性細胞或微球的比例以及平均熒光強度，與未標記對照組進行對比，計算出標記效率。

酶聯(lián)免疫吸附測定法

• 原理：利用抗原 - 抗體特異性結合的原理，將標記有熒光素的血紅蛋白作為抗原，與特異性抗體結合，再通過酶標二抗與一抗結合，最后通過酶催化底物顯色，根據顯色程度來間接反映標記效率。

• 步驟：將未標記和標記后的血紅蛋白分別包被在酶標板的不同孔中，加入特異性抗體孵育，洗滌后加入酶標二抗繼續(xù)孵育，最后加入底物顯色。通過酶標儀測定各孔在特定波長下的吸光度值，標記效率可根據標記后與未標記樣品的吸光度比值來計算。

放射性核素標記法

• 原理：在標記反應中加入一定量的放射性核素標記的熒光素，通過檢測標記后血紅蛋白的放射性強度，結合已知加入的放射性核素總量，計算出標記效率。

• 步驟：在標記反應體系中加入放射性核素標記的熒光素，如用放射性碘（12?I）標記的 FITC。標記反應完成后，用放射性檢測儀測量標記后血紅蛋白的放射性強度。根據加入的放射性核素總量和實際檢測到的放射性強度，通過公式計算標記效率：標記效率 =（標記后樣品放射性強度 / 加入的放射性核素總放射性強度）×100%。

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