活性酯法

• 步驟：首先將 FITC 與 N - 羥基琥珀酰亞胺（NHS）和 N,N’- 二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）在有機(jī)溶劑如二氯甲烷或 N,N - 二甲基甲酰胺（DMF）中反應(yīng)，生成 FITC 的活性酯中間體。然后將丙酮酸與三乙胺等堿混合溶解在適量有機(jī)溶劑中，再將上述活性酯中間體溶液緩慢滴加到丙酮酸溶液中，在室溫或適當(dāng)溫度下攪拌反應(yīng)數(shù)小時(shí)至過夜。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)過萃取、洗滌、柱層析等純化步驟，得到 FITC - 丙酮酸。

• 優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件相對溫和，產(chǎn)率較高，產(chǎn)物純度較好，適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模合成。

• 缺點(diǎn)：需要使用有毒的有機(jī)溶劑，反應(yīng)步驟相對較多，操作較為繁瑣。

碳二亞胺法

• 步驟：將 FITC 和丙酮酸溶解在合適的有機(jī)溶劑中，加入適量的 N,N’- 二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）作為縮合劑，同時(shí)可加入少量的 4 - 二甲氨基吡啶（DMAP）作為催化劑，在室溫或低溫下攪拌反應(yīng)一段時(shí)間。反應(yīng)完成后，過濾除去生成的二環(huán)己基脲沉淀，然后通過柱層析、重結(jié)晶等方法對產(chǎn)物進(jìn)行純化。

• 優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)較為直接，無需先制備活性酯中間體，減少了反應(yīng)步驟。

• 缺點(diǎn)：DCC 在反應(yīng)過程中可能會(huì)與水反應(yīng)生成副產(chǎn)物，影響反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn)物純度，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)體系的無水條件。

酶催化法

• 步驟：利用特定的酶作為催化劑，在生物相容性的緩沖溶液中，使 FITC 與丙酮酸發(fā)生特異性的反應(yīng)。例如，某些酯酶或轉(zhuǎn)移酶可以催化 FITC 上的活性基團(tuán)與丙酮酸的羧基或羰基發(fā)生反應(yīng)，形成 FITC - 丙酮酸。反應(yīng)過程中需要控制好酶的用量、反應(yīng)溫度、pH 值等條件，以確保反應(yīng)的高效進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，可通過超濾、凝膠過濾等方法將酶與產(chǎn)物分離，再進(jìn)一步純化產(chǎn)物。

• 優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，具有高度的選擇性和特異性，對環(huán)境友好，產(chǎn)物的生物相容性較好。

• 缺點(diǎn)：酶的成本較高，穩(wěn)定性較差，容易失活，且反應(yīng)的底物范圍較窄，需要針對特定的反應(yīng)進(jìn)行酶的篩選和優(yōu)化。

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